微生物实验样本获取及制备指南(上篇) | 16S专题-技术前沿-资讯-生物在线

微生物实验样本获取及制备指南(上篇) | 16S专题

作者:联川生物技术公司 2017-05-22T11:07 (访问量:4162)

编者按
在16S测序项目中,高质量的DNA是得到完美结果的第一步。即使实验设计及样本处理都十分严谨,但是在取样时稍一不注意,样本遭到破坏,那么测序数据必然不会完全符合预期了。因此,取样及提取是大家都十分关心的问题,经过我们实验团队多年的经验,我们对各种不同的微生物样本取样及DNA提取均做了总结汇总,便于大家参考。

粪便样本的收集及提取

收集样本:一般对于人的粪便,要求用无菌粪便收集器或其他灭菌器皿收集粪便样本,要注意即刻进行样本标记并低温保存(考虑到患者样本可能无法取样后直接分装标记,可以先在低温条件下保存,尽快进行分装标记);对于小鼠粪便,分别收取采样小鼠的粪便,立即进行收取,尽量不要暴露在空气中太长时间,避免污染和降解;

分装保存:由于有些样本取样不易,因此我们建议一次收集后分装保存,对于人的粪便,我们建议使用无菌牙签挑取内部样本,尽量排除空气污染及防止样本降解,使用灭菌离心管分别称取0.2g左右的样本,每个样本分装10管左右备用,标记好后即刻放入-80℃保存。当然由于小鼠个体较小,可能粪便样本不足0.2g时,我们可以适当将多个生物学重复样本进行混合,进行保存。

建议:一般来说,每次实验取用一管,用过后将剩余样本丢弃;并且若遇上收集困难或者十分珍贵的样本,请老师注意备份,避免再次收集耗费更大的人力物力,并且无法保证实验条件完全一致,导致后续分析无法达到预期。

土壤样本的收集及提取

样本收集:取样区域一般是根据实验设计进行选择,建议选取具有代表性的土壤;采样时使用的所有工具、采集袋或其他物品均要使用已灭菌的;若野外没有合适的条件进行灭菌处理,可以使用采集的土壤对取样工具进行擦拭,尽量去除干扰;采集时一般选 取 5-10 cm处土壤,去除杂质,将一定量的土壤进行分装标记,每袋样品约5-10 g, 密封后立即低温保存。

建议:土壤取样时时常会碰到杂质含量较高,取样时需要对杂质进行过滤,避免石块等杂质戳破采集袋等情况的发生,也会给后续提取造成干扰;

肠道内容物的收集及提取

样本收集:一般取样时实验对象已死亡(动物),需要使用无菌的解剖刀,尽量在无菌状态下取出整个肠道,将实验所需的肠段的内容物切下,将内容物取出放置在无菌离心管中,建议分装保存,便于后续实验需求,低温保存运输;若是无法立即抽提,建议将样本先置于液氮中冷冻4小时以上,保证冷冻充分再转移到-80℃保存。

建议:由于肠道内容物来源不一,一般来说保存单个样本取样量如下:大型动物,如牛、羊500 mg-1000 mg/管;中型动物,如大鼠、家兔 200-1000 mg/管;小型动物,如小鼠 200-500 mg/管;对于肠道内容物较少动物,如鱼、 虾 ≥100 mg/管。为保证实验顺利进行,在采样允许的情况下,尽量多采集样品。

肠道粘膜微生物的收集及提取

样本收集:实验操作在无菌条件下进行,将整个肠道移出体外,将肠系膜的对面纵向切开,使肠腔外露;使用无菌器械将肠道内容物清理干净后,用无菌生理盐水清洗肠腔,为了避免扰破坏乱肠粘膜,需将看得见的肠道内容物轻轻去除;用无菌载玻片轻刮肠道粘膜(避免穿透基底膜)。所有样品取完后立即放入液氮冷冻,并放在-80℃冰箱保存。

建议:由于肠道黏膜微生物收集要求较多,而采集到的黏膜微生物比较少,建议重复上述步骤多次,但必须在无菌环境下操作,保证足够取样及保存。

生殖道微生物的收集及提取

样本收集:取样对象需48h内无性行为,不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为, 30天内不能用抗生素和抗真菌类药物,以免导致菌群结构变化;取样时用无菌棉签擦拭,充分取样,用无菌剪刀剪下棉签头部,放入装有Amies培养基的无菌离心管中,立即-80℃保存。

建议:生殖道微生物收取不易,样本珍贵,需进行多管备份保存;提取DNA时需先将棉签低温解冻,漩涡处理5min以重悬细胞。

口腔微生物的收集及提取

样本收集:口腔微生物收集可以有两种方法供选择:

推荐)根据研究目的选定时间段对24h内不刷牙的受试者进行取样;取样前漱口,用无菌金属环轻轻刮取牙齿表面10-20次;将其置于装有1ml盐溶液的1.5ml无菌离心管,盐溶液经过UV照射以避免DNA污染;将样本混合完全后-80℃保存;

根据研究目的选定时间段对24 h内不刷牙的受试者进行取样,使用特定唾液取样器;受试者向取样器中吐2-3次唾液(一次约1 ml);将配套的DNA稳定剂加到唾液中;密封后,做好样品标记,-80℃保存。由于唾液中含有抑菌成分且宿主DNA过多,不推荐使用此方法

建议:不同研究目的受试者情况不同,建议取样时进行多管备份保存,以备后续实验需求。


未完待续,由于篇幅有限,样品获取及制备(上篇)就写到这里,下篇还有更多内容的哦~


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