软琼脂克隆实验

软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验(Anehorage-independentassay），利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。

软琼脂克隆形成实验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，主要反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

Part 01.

实验材料

细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、琼脂糖、结晶紫

细胞培养板、微量离心管（EP管）、移液吸头、移液枪

Part 02.

实验操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%琼脂（Agarose 加蒸馏水配置），高压灭菌后4摄氏度冰箱保存。铺板当天微波炉或烘箱加热融化，置于37摄氏度培养箱中。

2.铺下层胶：按1：1比例混匀1.2%Agarose和20%1640，6孔板每孔取2毫升混合液，在室温条件下等待冷却凝固。

3.取对数生长期细胞，消化配置成单细胞悬液，计数后将细胞数调整为5*10^4/毫升。

4.铺上层胶：按1：1比例使0.7%Agarose和20%1640培养基混匀，取2毫升混合液于EP管中，向管中加入10-20微升细胞悬液，充分混匀后加入已铺下层胶的6孔板中，待上层琼脂凝固后，放在37摄氏度培养箱中培养2-3周，每三天向孔板中加入200微升培养基。

5.显微镜下拍照，统计克隆直径并作图。

常见问题与解答

Q：细胞密度为多少合适？

A：细胞接种密度与最终实验结果密切相关，若细胞太多，形成克隆数目太多，处理结果时数克隆不仅容易出错，而且图片很难看（下图左）。细胞太少，不能形成克隆。如下图所示：

上图我们看到3株癌细胞在6孔板克隆形成图片，第一个明显铺板细胞太密集，导致难以统计数据；中间那个正好，最后面那个细胞数量偏少，且细胞铺板不均匀。因此，为了获得美观的图片和准确的数据，第一次实验最好设置细胞接种梯度，如500-1000-2000-5000个/孔挑选出最合适的接种密度。细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；另外注意细胞计数时建议多计数几次。

Q：细胞接种后培养的时间，如何确定？

A：通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而已异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。

Q：细胞铺板均匀的重要性

A：若铺板不均匀，细胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影响统计结果，并且拍出的图片不美观。

Q：细胞未形成克隆的原因？

A：并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度，加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长，应给细胞多加培养基，如每孔4ml，或者3天更换一次培养基，以供给细胞充足的营养。

Q：计数时克隆数目较多，有什么快捷办法？

A：只要细胞铺板均匀，我们可以选择分区计数，取平均数。

注意事项

1.细胞一定要吹打分散成单细胞悬液

2.接种时细胞密度不可过高

3.软琼脂与细胞混合时温度不可过高，容易烫伤甚至烫死细胞。

4.软琼脂对热和酸不稳定，反复加热容易降解并产生毒性，且容易造成硬度下降，因此需要高压灭菌后进行分装。

5.铺板操作时速度要快，以免造成局部凝固。