5301说明书

鬼笔环肽

简介

肌动蛋白是一种球状的，大约42kDa的蛋白质，几乎存在于所有真核细胞中。 它也是最高度保守的蛋白质之一，与藻类和人类不同的物种相差不超过20％。 肌动蛋白是细胞中两种细丝的单体亚基：细丝，细胞骨架的三个主要成分之一，以及细丝，是肌细胞中收缩装置的一部分。 因此，肌动蛋白参与许多重要的细胞过程，包括肌肉收缩，细胞运动，细胞分裂和胞质分裂，囊泡和细胞器运动，细胞信号传导，以及细胞连接和细胞形状的建立和维持。

我们的鬼笔环肽缀合物选择性地结合F-肌动蛋白。用于纳摩尔浓度的鬼笔环肽衍生物是方便的探针，用于标记，鉴定和定量甲醛固定和透化组织中的F-肌动蛋白切片，细胞培养或无细胞实验。鬼笔环肽比肌动蛋白更紧密地结合肌动蛋白丝单体，基本上导致肌动蛋白亚基从长丝末端解离的速率常数降低通过防止长丝解聚来稳定肌动蛋白丝。此外，发现鬼笔环肽可抑制鬼笔环肽F-肌动蛋白的ATP水解活性。鬼笔环肽在细胞中以不同浓度起作用不同。介绍时在低浓度的细胞质中，鬼笔环肽募集较少聚合形式的细胞质肌动蛋白和细丝蛋白进入聚集的肌动蛋白聚合物的稳定“岛”，但它不会干扰应力纤维，即厚的束微丝。鬼笔环肽的性质是通过标记研究细胞中F-肌动蛋白分布的有用工具鬼笔环肽与荧光类似物并用它们染色肌动蛋白丝用于光学显微镜检查。荧光衍生物鬼笔环肽已经证明非常适用于定位活细胞或固定细胞中的肌动蛋白丝以及用于定位肌动蛋白丝在体外可视化单个肌动蛋白丝。荧光鬼笔环肽衍生物已被用作该中的重要工具

肌动蛋白网络的高分辨率研究。 AAT Bioquest提供各种荧光鬼笔环肽衍生物用于多色成像应用的不同颜色，如下表所示。

光谱特性

鬼笔环肽缀合物的激发和发射最大值总结在下表中

*由于其基本相同的光谱特性，优异地替代德克萨斯红鬼笔环肽缀合物。

储存和处理条件

荧光鬼笔环肽缀合物是DMSO中的1000X储备溶液或冻干粉末。 如果储存在-20°C，溶液和粉末应稳定至少6个月。 保护荧光共轭物免受光照，并避免冻/融循环。

注意：鬼笔环肽是有毒的，虽然小瓶中存在的毒素量只能对蚊子致死（鬼笔环肽的LD50 = 2 mg / kg），但应小心处理。

分析方案

简要总结

在微孔板孔中准备样品®

从板中的样品中去除液体®

添加鬼笔环肽-iFluor™溶液（100μL/孔）®

在室温下染色细胞20到90分钟®

洗涤细胞®

在显微镜下检查样品

注意：将小瓶加热至室温并在打开前短暂离心

操作步骤

1. 制备1000 X鬼笔环肽DMSO储备液：将30μLDMSO加入粉末形式的小瓶中。

2. 制备1X鬼笔环肽缀合物工作溶液：通过将1μL1000X鬼笔环肽缀合物DMSO溶液加入1mL含1％BSA的PBS中。

注1：鬼笔环肽缀合物的未使用的1000X DMSO储备溶液应等分并储存在-20℃，避光保存。

注2：不同的细胞类型可能染色不同。 应相应地制备鬼笔环肽缀合物工作溶液的浓度。

3. 染色细胞：

3.1进行甲醛固定。 在室温下将含有3.0-4.0％甲醛的细胞在PBS中孵育10-30分钟。

注意：避免使用任何含甲醇的固定剂，因为甲醇会在固定过程中破坏肌动蛋白。 优选的固定剂是不含甲醇的甲醛。

3.2用PBS冲洗固定的细胞2-3次。

3.3可选：将0.1％Triton X-100在PBS中加入固定细胞（来自步骤2.2）3至5分钟，以增加渗透性。 用PBS冲洗细胞2-3次。

3.4将100μL/孔（96孔板）的鬼笔环肽偶联物工作溶液（来自步骤1）加入固定的细胞（来自步骤2.2或2.3），并在室温下染色细胞20至90分钟。

3.5用PBS轻轻冲洗细胞2至3次以除去过量的鬼笔环肽结合物，然后在显微镜下进行电镀，密封和成像。

参考文献

1. Mirko Messa, Rubén Fernández-Busnadiego, Elizabeth Wen Sun, Hong Chen, Heather Czapla, Kristie Wrasman, Yumei Wu, Genevieve Ko, Theodora Ross, Beverly Wendland, and Pietro De Camilli. Epsin deficiency impairs endocytosis by stalling the actin-dependent invagination of endocytic clathrin-coated pits. eLife Sci. 2014; 3:e03311.

2. Szczesna D, Lehrer SS (1993). The binding of fluorescent phallotoxins to actin in myofibrils. J Muscle Res Cell Motil, 14(6), 594.

3. Johnson S C, Nancy M. McKenna M N, and Wang Y (1988). Association of microinjected myosin and its subfragments with myofibrils in living muscle cells. J Cell Biol, 107(6), 2213.

4. Wang K, Feramisco JR, Ash JF (1982). Fluorescent localization of contractile proteins in tissue culture cells. Methods Enzymol, 85 Pt B, 514.

5. Miki M, Barden JA, dos Remedios CG, Phillips L, Hambly BD (1987). Interaction of phalloidin with chemically modified actin. Eur J Biochem 165, 125.

6. Cooper JA. (1987). Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J Cell Biol 105, 1473.