当前，环境污染已成为全球性的重大问题，环境污染物对人类健康和环境生态的影响备受关注。在环境污染物研究中，毒性评价是评估污染物风险的重要手段。
斑马鱼胚胎急性毒性评价作为一种常用的生态毒性评估方法，其快速、敏感、有效，通过将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的测试物质中，并观察和记录胚胎的存活率、发育异常和其他毒性效应等，从而评估不同有机污染物（如多环芳烃、农药等）、重金属污染物（如铅、汞、镉等）及新型污染物对胚胎的毒性效应，有机污染物的暴露可导致胚胎生长发育迟缓、畸形率增加等毒性效应，评价化学物质对斑马鱼胚胎发育的潜在影响，被广泛应用于环境监测、化学物质毒性作用机理研究、有毒物质拮抗剂的筛选、化学品安全性评价和生态风险评估等领域。
本文将对胚胎急性毒性评价方案及其在环境污染物中的应用进行概述，以期为环境污染物的风险评估和控制提供科学依据。
01、斑马鱼胚胎急毒性评价优势
基于斑马鱼胚胎对外界毒性物质的敏感性、其发育过程的透明性等特性，斑马鱼胚胎急性毒性评价通过将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的环境污染物中，观察其存活率、生长发育、畸形率等生物学指标的变化，从而评估污染物对斑马鱼胚胎的毒性效应，并预测其可能对人类健康和环境生态产生的影响。
这种评价方法具有快速、敏感、准确和可靠的特点，因此，在环境污染物风险评估、环境监测及药物安全性评价等领域得到了广泛应用。
与人类高达87%的基因同源性
斑马鱼的基因组与人类有高达87%的相似度，且其毒性特征和信号传导通路与人类近似，使斑马鱼胚胎急性毒性评价的结果可以较好地反映化合物对人类可能产生的毒性效应；
对环境污染物非常敏感
斑马鱼胚胎对环境中的污染物非常敏感，当暴露于有毒物质时，其存活率、生长发育和形态学特征会发生变化，这些变化可以直接或间接地反映出污染物的毒性；
胚胎透明，便于观察
斑马鱼胚胎在体外发育，其通体透明，使研究人员可以在显微镜下实时观察和记录胚胎暴露于污染物后的各种生物学反应，直接观察胚胎的发育情况，从而评估污染物的毒性。胚胎及幼鱼通体透明，显微镜下可直接观察多种组织器官变化，实验结果直观易懂；
高通量高可靠
作为适用微孔板高通量筛选的脊椎动物，斑马鱼胚胎体积小，易于在实验室条件下进行大规模的培养和实验。通过进行斑马鱼胚胎高通量筛选，可以在短时间内对大量样品进行毒性评价，且样本数量大、个体差异小，结果更可靠，可以大大提高实验效率。
02、斑马鱼胚胎急毒性评价方案
近年来，斑马鱼胚胎急性毒性评价在环境污染物评价中发挥了重要作用，通过将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的污染物中，观察并记录胚胎的存活率、畸形率、孵化率以及发育过程中的各种生物学变化，可以评估污染物对斑马鱼胚胎的毒性效应，并预测其可能对人类健康和环境生态产生的影响。
实验原理
斑马鱼在24 hpf身体基本成形，在2-3 dpf时，胚胎已经孵化；22 hpf开始心跳，48 hpf完成心血管系统发育，在2 dpf时，斑马鱼心脏处于比较敏感阶段，因此比较适合用于研究心血管毒性；
3 dpf的斑马鱼肝脏结构和功能发育完全，在肝细胞组成、功能、信号转导、对损伤的反应以及介导肝脏疾病的细胞过程等方面与人类肝脏相似；胚胎和成年斑马鱼的肾脏解剖结构的分子特征揭示了细胞组成和肾单元段模式与人的总体保守性；
斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似，例如其视网膜和晶状体的形态和结构，以及其在5 dpf就具有视觉功能；36 hpf斑马鱼胃肠道开始发育，3 dpf时开始收缩，4 dpf斑马鱼肠道中已经出现微生物，同时胰脏等消化器官与斑马鱼肠道同步发育，5 dpf消化系统基本发挥功能。
斑马鱼体外受精和发育可以同时观察到颅面区、大脑、眼睛、心脏、肝脏、胃肠道、脊索、躯干、卵黄囊吸收、水肿、色素沉着、循环系统等大量毒理学终点，从而提供了理想的模型。
参考OECD 236斑马鱼急性毒性方法，在斑马鱼受精卵开始处理，可以客观的评价样品对于各个器官的毒性情况。
实验周期：4周
斑马鱼品系：野生型AB品系
给药周期：受精后1-1.5 h（4-16细胞期）-5dpf
评价指标
1、实验一：样品最大非致死浓度（MNLC）和10%致死浓度（LC10）确定
实验组别：共16组，共3个样品，正常对照组、每个样品5个检测浓度。
实验方法：样品处理结束后，进行表型观察。
评价指标：
实验组斑马鱼死亡数量，用Origin 8.0统计学软件绘制最佳的“浓度-死亡率”效应曲线，并计算样品对斑马鱼的MNLC和LC10。
实验周期：2周
2、实验二：样品胚胎急性毒性评价
实验组别：
共13组，共3个样品，正常对照组、每个样品4个检测浓度（常规为1/9MNLC、1/3MNLC和MNLC和LC10，或由委托方选择）。
实验方法：
随机选取4-16细胞期野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。每孔容量为3 mL。
①28 ℃处理至24 hpf时，每个实验组拍摄视频，分析斑马鱼自发运动；
②处理至48 hpf时，每个实验组在解剖显微镜下观察：卵凝结、体节形成异常、尾部延伸停止和无心跳，并统计发生率；
③处理至48 hpf时，每个实验组在解剖显微镜下观察并统计斑马鱼心率；
④处理至72 hpf时，每个实验组在解剖显微镜下观察并统计斑马鱼孵化率；
⑤处理至120 hpf时，每个实验组在解剖显微镜下观察并记录斑马鱼心脏、循环系统、出血及血栓、脑、下颌、眼睛、肝脏、肾、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、身体着色、体长等反应情况，采集典型毒性器官照片并。统计毒性发生率并鉴别毒性靶器官；
⑥处理至120 hpf时，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，分析斑马鱼体长；
⑦处理至120 hpf时，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于行为分析仪下，分析斑马鱼总运动距离，评价样品对运动功能的影响。
评价指标：
①胎动频次；
②卵凝结、体节形成异常、尾部延伸停止和无心跳发生率；
③心率；
④孵化率；
⑤评价指标：心脏（心包水肿、心律异常）、循环系统（血流加快、血流减慢/缺失）、出血和血栓、脑（脑变小、脑变性）、下颌（畸形）、眼（变小）、肝脏（增大、缩小/缺失、变性）、卵黄囊（吸收延迟）、肾（肾性水肿）、肠道（异常）、躯干/尾/脊索（弯曲、水肿）、肌肉/体节（变性）、鱼鳍（缺失）、体长（变短）、行为（异常）、身体着色（异常）、耳（变小）、鳔（缺失），并统计毒性发生率；
⑥体长；
⑦总运动距离
实验周期：2周
结果展示方式
（1）MNLC和LC10：提供“浓度-死亡率”效应曲线
图1. 斑马鱼“浓度-死亡率”效应曲线
（2）毒性表型评价：提供表型图
图2. 斑马鱼胚胎急性毒性表型图（注：B=脑；H=心脏；J=下颌；In=肠道；L=肝脏；Y=卵黄囊；E=眼睛）
图3. 斑马鱼早期发育阶段的致死指标代表图。A：卵凝结；B：心包水肿（*），←所指为体节；C：尾部未分离（←）和眼芽缺失（*）。图片来自OECD 236（2013）。
图4. 斑马鱼肝脏局部图。A图为正常斑马鱼，B图斑马鱼出现肝脏发黑（变性）和卵黄囊吸收延迟。绿色虚线所示为肝脏，红色虚线所示为卵黄囊。
图5. 斑马鱼肌肉变性典型图。A图为正常斑马鱼，B图斑马鱼出现肌肉变性（肌肉纹理不清晰、表面不平整、颜色偏暗）。
图6. 斑马鱼下颌畸形典型图。（A图为正常斑马鱼，B图斑马鱼出现下颌畸形（下颌发育延迟，不能与上颌咬合）
图7. 斑马鱼色素异常典型图和鱼鳔缺失典型图。A图为正常斑马鱼，B图斑马鱼色素异常（红色箭头）和鱼鳔缺失（绿色箭头标记）。
图8. 斑马鱼眼睛变小，心包水肿，肝变性，肠道异常典型图。A图为正常斑马鱼，B图斑马鱼眼睛变小（蓝色箭头）、心包水肿（红色虚线）、肝变性（黄色虚线）和肠道异常（绿色虚线）。
图9. 斑马鱼肾性水肿典型图。A图为正常斑马鱼，B图肾性水肿（红色箭头）。
图10. 斑马鱼身体弯曲典型图。A图为正常斑马鱼，B图身体弯曲（红色箭头）。
图11. 斑马鱼体长变短和心包水肿典型图。A图为正常斑马鱼，B图体长变短和心包水肿（红色虚线）。
图12. 斑马鱼出血典型图。A图为正常斑马鱼，B图出血（红色箭头）。
图13. 运动轨迹典型图（注：黑色线为慢速运动距离、绿色线为中速运动距离、红色线为快速运动距离）
图14. 总运动距离，与正常对照组相比，***p < 0.001
近年来，斑马鱼作为一种重要模式生物，在环境毒理评价领域的应用日益广泛。环特生物依托于斑马鱼+哺乳动物+类器官+基因编辑4大技术平台，基于过去10余年持续的技术创新实践，以专业、前沿的技术服务解决方案，助力环境毒理学研究与突破！
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