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客户文献解读| IF=7.7, 组学揭秘氧化石墨烯暗藏的抗菌机制

作者:武汉金开瑞生物工程有限公司 2019-11-25T13:32 (访问量:1007)

热烈祝贺河北科技师范学院 陈教授及其团队研究成果荣登Environmental Science Nano(IF=7.7,中科院1区)

题目:Metabonomics-assisted label-free quantitative proteomic and transcriptomic analysis reveals novel insights into the antifungal effect of graphene oxide for controlling Fusarium graminearum

期刊:Environmental Science Nano

影响因子:7.7

合作技术:Label-free​

研究背景

真菌病原体禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,FG)是镰刀菌枯萎病( Fusarium head blight,FHB)的病原体,镰刀菌是一种影响小麦和其他谷物(例如玉米)生产的全球性严重植物病。FG不仅造成作物产量和品质的重大损失,而且还会产生霉菌毒素,几乎破坏了受感染田间生产的所有谷物。传统上,最有效的方法是使用杀真菌剂(如多菌灵)进行化学控制,但是,农业中长期过度使用化学药品已经引起了许多严重的问题,包括增加的真菌抗性,化学残留物以及对环境和健康的危害。真菌对某些传统杀真菌剂产生的抗性使控制真菌的生长更加困难,鉴于当前控制措施的局限性以及FHB 对重要经济作物的严重影响,开发有效控制这些疾病的替代剂已迫在眉睫。

氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作为一种新型的抗植物病原体的抗菌剂开始被研究,并且被认为在农业科学中具有巨大的发展前景。之前已有文章对GO的抗菌作用进行了研究,然而对于GO的抗真菌模式仍然未知。

为了探究GO的抗菌机制,作者利用转录组,蛋白质组学和代谢组学技术,系统地研究了GO对重要的植物病原真菌禾谷镰孢(FG)菌株PH-1的抗真菌活性,探讨其抗菌机制,以便更好的利用G0服务农业生产和改善环境。

实验思路


实验结果

1. GO处理可以减少FG菌株PH-1的分支和生物量

用GO处理FG菌株PH-1,通过对菌丝分支和生物量的统计,发现随着GO浓度的增加,菌丝分支和菌丝体生物量都有明显的减少,说明GO影响菌株的生长和发育。


图1 菌丝分支/生物量随GO浓度变化

2.菌丝体在GO处理后丧失了细胞膜结构的完整性

作者利用SEM和TEM观察菌丝体对GO处理的超微结构变化。根据SEM图像观察到对照中的菌丝体保持了其膜结构的完整性,大多数菌丝体在GO处理后丧失了其细胞完整性,并变得伸长或扁平化。同时TEM图像显示,GO处理后,菌丝体细胞壁的电子密度降低,细胞壁分层不明显。此外,GO处理的菌丝体细胞中有更多的大隔室;还可以看出GO处理后菌丝中存在许多液泡,并且可以观察到膜融合的现象,这可能是由于GO处理引起的细胞膜通透性的变化。先前的研究表明,由于石墨烯与脂质分子之间的强相互作用,GO可以从大肠杆菌膜中破坏性提取磷脂。由此,可以推测GO可以帮助从菌丝体中破坏性提取磷脂并影响膜通透性,从而导致胞质外渗,继而在处理过的菌丝中形成较大的隔室。


图2 GO处理后的SEM 与TEM 图像信息


3.定量RT-PCR揭示GO浓度对菌株的影响

作者进一步检测了与菌丝体发育和分支相关的几个基因的表达水平,并且进行应激相关基因的表达检测。通过改变GO浓度,检测了septins,Pods,MAP激酶和Myo2等与菌丝体的发育和分支密切相关的基因,发现随着GO浓度的升高,这些基因的表达量明显降低;与应激相关的基因uspA1,uspA2和Sim表达量随浓度的升高有明显的升高;抑制细胞增殖的基因RAS2,随着GO浓度增加表达量也逐步增加。诸如此类,这些基因表达量的变化均表明GO处理能降低菌株细胞活力,减少菌株菌丝体的分支和生物量。


图3 RT-PCR检测相关基因表达


4.蛋白质组学要说的故事

a)通过Label-free无标记定量蛋白质组学,作者发现不同GO浓度处理,从根本上改变了菌株的基因本体条目,使菌株体蛋白表达水平发生了大的变化。其中,与细胞、代谢过程、细胞结构相关、催化活性、细胞过程等相关的蛋白质,以及应激蛋白和膜封闭蛋白的变化较为明显。

b)通过对差异蛋白的分析聚类,作者发现这些蛋白质主要参与能量、糖、氨基酸和N-聚糖的生物合成、脂肪酸代谢等途径。这些结果表明GO处理影响离子通道以及核苷酸和脂质代谢蛋白,这与菌丝体脱水,DNA和RNA含量降低以及细胞壁合成密切相关。这一发现与表型结果一致。

c)此外,作者进一步分析这些差异蛋白,发现部分差异蛋白的变化对维持菌株的生命活性起着重要的作用。即为了在不同浓度的GO处理下存活,FG菌株PH-1可能会降低蛋白质表达以及某些不必要的生理和生化反应,这一现象值得进一步研究。

d)差异蛋白 KEGG富集分析结果表明,GO处理导致FG菌株PH-1中与组氨酸代谢有关的蛋白质蓄积,这可能是GO在FG菌株PH-1上的抗真菌反应之一,而对组织特异性模块中蛋白质的COG分析表明,参与脂质合成的蛋白质减少可能是GO对FG菌株PH-1的另一种抗真菌反应。


图4 对照组与GO处理菌株FG株pH-1的蛋白质组学比较分析


图5 不同浓度氧化石墨烯处理的FG株PH-1蛋白表达层次聚类分析


图6 COG分析

5.代谢组学分析

最后作者从代谢组学分析结果中发现,GO处理后海藻糖含量增加,而海藻糖被认为是真菌的主要碳源,并且是发芽初期真菌中的重要抗应激物质,表明海藻糖可当作禾谷镰刀菌响应GO处理的一种生物标志物。GO处理后组氨酸的含量增加,也表明FG遭受GO诱导的应激。此外,作为真菌细胞壁的重要成分,脂质在GO处理后含量显着下降。这可能会导致细胞壁成分减少,从而导致细胞壁不健康。 这与作者的SEM和TEM观察结果一致。



图7代谢组学分析

小结

在这项工作中,作者研究了GO在基因、蛋白质组和代谢水平三个层面上抑制FG菌株PH-1的生长和分支的分子抗真菌机制。在基因水平上,基因的异常表达会抑制菌丝体的分支和成熟,从而降低菌丝体的生物量;在代谢水平上, GO处理能引起代谢途径和组氨酸代谢的富集,推测组氨酸代谢可能是GO在蛋白质水平上的抗真菌反应之一,是应激反应的生物标志物;在蛋白水平上,参与细胞壁合成的脂质蛋白的数量在蛋白质水平上降低,影响菌丝体细胞壁合成。通过本次工作,作者提出GO对FG菌株PH-1的抗真菌活性可能是由于该菌株在转录、蛋白质和代谢水平上与GO的协同反应,并且这种潜在的抗真菌机制也可能通过使用GO来有效控制其他真菌。未来的研究可以在生物测定中加入其他重要的植物病原菌,扩大氧化石墨烯的抗真菌活性谱。此外,将现有的杀菌剂与氧化石墨烯相结合,研制出具有不同作用模式的新型氧化石墨烯杀菌剂,这可能是控制作物中植物病原体的另一种有效途径

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