Chromium Single Cell 3’Solution平台应用系列三:在干细胞研究中的应用-技术前沿-资讯-生物在线

Chromium Single Cell 3’Solution平台应用系列三:在干细胞研究中的应用

作者:北京博奥晶典生物技术有限公司 2018-01-31T09:38 (访问量:6824)

 

       干细胞能够分化成为机体内任何类型的细胞,既是研究人体早期发育的理想工具,也是细胞治疗的宝贵资源,在医学领域有非常广泛的应用。干细胞及其分化细胞的异质性是干细胞的固有特性,如果我们使用一群细胞进行测序就会掩盖这种异质性。而单细胞测序可以帮助我们挖掘这种异质性,寻找细胞群体的变化及发生机制。

 

图1 干细胞发育以及分化研究

 

从2016年十三五计划开始后,在生物科研领域,干细胞的研究就作为一个重点课题受到科技部的特别支持,并作为首批进入国家重点研发计划的专项。2016年和2017年科技部发布的“干细胞及转化研究”专项,每次支持项目40个左右,单个项目从500万~3000万不等,总经费支持达到数十亿,主要聚焦在干细胞及转化研究的重大基础科学问题和瓶颈性关键技术,力争取干细胞及转化研究得科学理论和核心技术的原创突破,推动干细胞研究成果向临床应用转化,整体提升我国干细胞及转化应用研究水平。

 

总结近两年的重点专项课题,干细胞及转化的研究主要集中在以下几个方向:①细胞重编程构建多能干细胞;②组织干细胞的获取及功能、调控;③干细胞定向分化及细胞转分化;④干细胞移植后体内功能建立与调控;⑤基于干细胞的组织和器官功能再造;⑥干细胞资源库;⑦利用动物模型的干细胞临床前评估;⑧干细胞临床研究。

 

 

ChromiumTM Single Cell 3' Solution作为一个高通量的单细胞测序技术,全面剖析干细胞的异质性,帮助鉴定不同表型的细胞,在干细胞领域有非常广泛的应用。目前该技术在干细胞领域的研究一共发表了多篇高水平的文章,聚焦的方向包含了多能干细胞、器官干细胞(肠道、泪腺)、间充质干细胞的分化干细胞重编程过程以及自我更新机制等。小编做了汇总,供各位科研达人参考。

表1 ChromiumTM Single Cell 3’ Solution在干细胞领域发表文章汇总

 

在干细胞领域发表的文章影响因子都很高,那么这些如此有影响力的文章都在研究什么?如何设计的课题呢?小编详细解读了2篇用ChromiumTM Single Cell 3’ Solution发表的研究干细胞的文章,继续给科研达人们参考。

 

 

 

 

 

案例一
不同的肺间质细胞系促进肺部上皮的自我更新和瘢痕组织形成机制

 

 

 

 

 

 

Distinct Mesenchymal Lineages and Niches Promote EpithelialSelf-Renewaland Myofibrogenesisinthe Lung

期刊:《Cell》发表时间:2017.9 影响因子:28.71发表单位:美国宾夕法尼亚州费城儿童医院儿科心脏病科,宾夕法尼亚大学

 

 

 

 

 

1、研究背景

 

在成体肺组织中,上皮祖细胞从周围的间质细胞中获得旁分泌信号,这些信号可以调节上皮祖细胞进行增殖和分化。哺乳动物的肺组织包含大量的特定的上皮细胞,其被包围在定义不明的异质间充质中。肺间质隔室包括气道平滑肌(ASM),血管平滑肌(VSM),内皮细胞和界限不清的间质细胞。为了鉴定参与并提供信号以促进肺泡自我更新和再生的细胞谱系,并表征特征基因,我们使用10X单细胞转录组测序技术检测发现整个肺间质分选为五类基于信号转导途径读出的不同细胞谱系。

 

2、研究方法

 

研究人员使用单细胞转录组测序和信号谱系记录产生空间和转录肺间质图。发现每一个间充质谱系具有明显的空间位置和转录导致独特的利基(生态位)监管职能。间质性肺泡利基细胞Wnt信号响应,表达血小板衍生生长因子受体,对于肺泡上皮细胞生长和自愈是至关重要的。

 

2.1 流式分选5,572个小鼠肺间质细胞使用ChromiumTM Single Cell 3’ Solution进行单细胞转录组测序:获得每个细胞68k Reads数,中值基因1,017,每个细胞的平均UMI计数为2,040;

 

2.2 Axin2CreERT2:tdT和PdgfrɑCreERT2用于谱系追踪。

 

3、研究结果

 

3.1 信号通路报告系统可以识别和鉴定不同的成年肺间质谱系;

我们使用最近描述由我们实验室合成的Axin2CreERT2连同Wnt2CreERT2和PdgfraEGFP这些示踪信号,鉴定Wnt或Pdgfr信号活动和表达的间充质细胞的相对位置和分布来解析成年鼠肺间充质隔室的复杂性。Wnt-反应的Axin2+细胞可以在整个成年鼠肺间质、肺泡区和周围的导管气道和血管中发现(图1A-1D和图2A-2D)。肺泡中许多Axin2-衍生细胞表达Pdgfrɑ,而Axin2+伴随气道的谱系跟踪细胞主要表达Pdgfrβ(图1E-1H)。

 

图2 信号追踪鉴定成年小鼠肺中不同的间充质细胞和间质细胞的AXIN2表征

 

使用Wnt2CreERT2与R26REYFP示踪基因杂交,我们证明Wnt2+细胞仅分布于肺的肺泡区域。此外,使用免疫染色Wnt2CreERT2:R26RtdTPdgfrɑ小鼠,PdgfrɑEGFP示踪数据表明,肺泡间充质细胞是区域分布的,可以根据Axin2,Wnt2和Pdgfrɑ的表达分为几种不同的类型。总体而言,在肺泡区域发现Axin2+/Pdgfrɑ+细胞和Wnt2+/Pdgfrɑ+细胞,而Axin2+/Pdgfrɑ细胞主要存在于周围的气道或血管中,表明这些不同谱系中的每一个在肺中具有独特的空间位置(图3)。

 

图3 免疫组织化学染色追踪特征基因在不同细胞的表达及间充质细胞种群的分布图

 

3.2 谱系特异性和单细胞转录组测序分析揭示了成熟肺中独特的间充质谱系。

为了进一步评估上述各种间充质细胞类型,我们进行了群体RNA测序分析和单细胞RNA测序分析。为了获得上述五种不同细胞群的深度测序,基于存在或不存在Axin2,Pdgfrɑ和Wnt2表达(图4A和图5E、F、G),使用荧光激活细胞分选来分离这些细胞。

 

图4 肺间质细胞具有不同的转录组

 

 

图5 为每个肺制备单细胞悬液,对于肺间质的FACS分离

 

荧光激活细胞分选能够分离大于90%的肺中的活Epcam-/CD31-/CD45-细胞群体,构成绝大多数的肺间充质隔室(图6H、I)。

 

图6 Axin2-tdTomato标记了成年鼠肺的所有细胞的约36.6%

 

群体RNA测序数据的主成分分析(PCA)显示,所有五个群体都显示出显着不同的转录组(图7B)。

 

图7 来自五个间充质群体的群体RNA测序的三维主成分分析(PCA); n = 2只小鼠

 

已知的间质标志物,包括群体RNA测序数据中的信号传导和结构基因的分析显示,“其他”和Axin2+细胞表现出具有丰富的基因表达的平滑肌,肌成纤维细胞或周围细胞样细胞的特征,例如Acta2,Tagln和Des(图8A、D)。Pdgfrɑ+,Axin2-Pɑ+和Wnt2+细胞表现出与在肺泡中发现的产生基质的成纤维细胞相关的基因的富集表达,如Elastin(Eln),Pdgfrɑ(Pdgfrɑ)和Collagen(Col1a1)(图8)。

 

图8 所选谱系富集基因的热图。五个不同细胞群体中每一个的特定基因的简要列表显示在右侧D

 

在间质中表达的肌成纤维细胞标记,富含Axin2+细胞,用于指示肌成纤维细胞谱系的基因,包括Acta2和Aoc3。分析显示,通过功能性报告读数识别的不同间充质细胞类型代表不同的簇,来源于簇4(C4)表示的Axin2+细胞,簇2(C2)表示的Axin2-Pɑ+细胞,Wnt2+由簇1(C1)表示的细胞(图9)。

 

图9 来自谱系和单细胞RNA测序的间质标记表达

 

使整个肺间充质群体进行插入型单细胞RNA测序分析(图4A)。评估来自5,572个肺间质细胞的单细胞RNA测序数据,t分布随机相邻嵌入(t-SNE)的聚类分为五个不同的组,每组由超过90个单元组成(图10)。一些候选间质标志物的表达显示簇4和5含有大部分Pdgfrɑ+细胞,簇2和3包含大多数Acta2-,Tagln-和Des-表达细胞(图10)。在第2,3,4组中表达了Pdgfrβ,Col1a1在所有簇中均被广泛表达(图10C)。

 

图10 使用K-means(K = 10)的5,572个细胞的单细胞RNA-seq应用于二维tSNE图以鉴定不同的间充质细胞群,每个簇中的最高度表达的基因分析表明,集群5代表上皮细胞没有使用流式细胞仪分离除去

 

图11 从1-5列中的顶级基因产生的热图,右侧概述,log2倍变化大于2,p值小于0.05

 

3.3 用空间距离映射算法对肺泡壁龛中上皮间充质相互作用的研究。

为了确定上述定义的间充质谱系有助于形成具有AT2细胞群体的肺泡利基,我们开发了使用AT2细胞作为锚点的空间距离映射算法(图12A),为我们发现的每个间充质谱系定义一个独特的空间地址。SDM基于使用共聚焦显微镜的三维渲染以使用DAPI染色测量核-核的距离来鉴定所述细胞类型与表达Sftpc的AT2细胞的相对位置(图12B)。鉴于它们优先靠近AT2细胞,这些数据表明Axin2-Pɑ+间充质谱系是可能优先与AT2细胞通信的肺泡利基的关键组分(图12J)

 

图12 距离定位肺中的肺泡利基

 

4、研究结论

 

本研究通过群体单细胞转录组测序构建了肺间质的空间转录组图谱。间充质肺泡壁龛细胞主要是Wnt应答,表达Pdgfra,并且是肺泡上皮细胞生长和自我更新的关键。而Axin2+的肌纤维祖细胞在损伤后首先分化成具有病理损害的肌纤维细胞。这些研究定义了肺间质的细胞种类和分子框架,并展示了在组织损伤后自我更新对抗病理反应的重要的发育通路。为肺部损伤治疗提供了重要的参考。

 

案例二

群体单细胞转录组测序解析Lgr5+肠道干细胞自我更新过程中Wnt和R-spondin(蛋白配体)的不等效性

 

Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+intestinal stem-cell self-renewal

期刊:《Nature》,2017.03 影响因子 :38.138 发表单位:美国斯坦福大学医学院

 

1、研究背景

 

典型的Wnt信号通路和β-连环蛋白信号通路控制着不同的发育、稳态和病理过程。Wnt配体与受体LRP5、LRP6等,使β-连环蛋白的核转位和依赖TCF/LEF的基因转录。蛋白配体(RSPO1 -RSPO4)作用于不同的LGR-LGR6、RNF43和ZNRF3受体,其能增强Wnt /β-catenin信号,在体外诱导肠道器官的生长,在体内诱导Lgr5+肠干细胞分化。然而,Wnt与蛋白配体(RSPO)的互换性、功能合作和相对贡献在体内调控Wnt信号和肠道干细胞生物学中仍然未知。本文通过群体单细胞测序探索肠道干细胞自我更新过程中Wnt信号的作用机制。

 

2、实验方法

 

2.1 小鼠体内注射腺病毒编码Wnt和RSPO激动剂或抑制剂26h,然后取近端空场消化为细胞悬液;

 

2.2 使用GemCode系统流式分选了13,102个Lgr5-eGFP+细胞,单细胞捕获效率超过50%;

 

2.3 用FACS净化的近端空肠Lgr5-eGFP+细胞进行单细胞RNA测序。

 

3、研究结果

 

3.1 LGR5-,RNF43-和ZNRF3-ECD诱导的Lgr5+ISCs的消耗不是由于隐窝细胞凋亡或增殖改变的。

用RSPO受体LGR5、ZNRF3或RNF43的可溶性胞外区(ECDs)来抑制内源性RSPO信号,并将RSPO1-RSPO4结合在一起小鼠静脉注射腺病毒大约14-96天后,在肝脏转导和分泌,强烈表达人LGR5、小鼠ZNRF3或小鼠RNF43的ECDs(图13)。

 

图13 单次静脉注射腺病毒至C57B1小鼠后血清表达的时间过程

 

为了检测pan-RSPO1-RSPO4抑制对Lgr5+胞外区的影响,小鼠静脉内注射编码LGR5 ECD,ZNRF3 ECD或RNF43 ECD的腺病毒或编码IgG2ɑFc的对照腺病毒。RSPO1过表达扭转了双胞外区(ECDs),但没有Ad-Dkk1表型(图14a)。尽管定量Lgr5+ECD耗竭,单一LGR5, RNF43 或ZNRF3-ECD仍保留了隐窝增殖和Axin2-LacZ 报告信号(图14a,d),可归因于剩余的传输扩增细胞或非蛋白配体(rspo)依赖性群体。

 

图14 a上部:LGR5、RNF43或ZNRF3 ECD在注射后2-14天可逆地消融小肠中eGFP标记的Lgr5细胞的表达,下部:血红素和伊红染色(H&E)染色

 

图14 d单而非双ECD RSPO抑制在axin2-lacz Wnt报告小鼠中保存Ki67+隐窝增殖和隐窝基底Wnt信号

 

北京博奥晶典生物技术有限公司 商家主页

地 址: 北京市亦庄经济技术开发区科创六街88号,亦庄生物医药园C座

联系人: 市场部

电 话: 18600397163

传 真:

Email:zhiyuanjing@capitalbiotech.com

相关咨询
ADVERTISEMENT