原代肝细胞是一类从动物肝脏获得后立即培养的肝细胞。由成人原代肝细胞（adult primary human hepatocyte, PHH) 分化培养得到的类器官因保留有体内生理环境、肝细胞的完整形态和生理功能，往往被视作为体外代谢药物实验与体外肝细胞培养模型的“金标准”，有助于研究药物代谢和毒性、病毒感染和遗传疾病等。
然而，体外培养的PHH往往只能保留几天的代谢活性，随后将会去分化并凋亡。为此，研究人员探索了各类可能的替代方法。例如，使用层胶原凝胶或Matrigel包裹原代肝细胞的2D“三明治培养”；或与肝脏非实质细胞共培养，但效果皆不尽如人意。而使用其他来源的肝细胞替代，如癌细胞系来源，虽会保有增殖能力、但缺乏正常肝细胞关键特征。
2013年，荷兰研究团队在培养体系中加入肝细胞生长因子 (HGF)、表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF) 等组分后，成功建立了老鼠来源的肝脏类器官体系。可惜多种药物在动物模型上和临床表现存在较大出入。而来自于人多能干细胞或胎儿肝细胞 (human fetal hepatocytes, FH) 的模型也被发现会产生巨噬细胞招募因子与抗纤维化M2巨噬细胞极性因子高度表达等与PHH有显著区别的特性。
2024年5月13日，来自荷兰乌特勒支大学，被誉为“类器官之父”的Hans Clevers教授，带领团队在期刊Nature Communications上发表了题为“Mapping of mitogen and metabolic sensitivity in organoids defines requirements for human hepatocyte growth”的研究论文。
通过追踪人类来源成人肝细胞培养中的时间转录组和表型变化，并将其与胎儿来源肝细胞进行比较，研究团队首次发现基于成人肝细胞的类器官培养中存在增殖启动和脂质代谢抑制的缺失，并证明在补充IL6+FXRa等生长相关因子后，具有成年肝细胞特征的类器官可在体外培养长达四个月，为基于PHH的类器官体外培养提供了新的线索。
细胞增殖基因与脂肪代谢基因表达成动态相反趋势
研究团队选取来自两个供体的FH，在播种后三天内成功观察到小型类器官组织的出现，并经荧光鉴定确认甲胎蛋白和白蛋白等肝细胞特异性蛋白的存在，同时发现胆管细胞的缺失。
其后根据时间分辨转录组学结果，研究人员将相关基因分为7簇。其中基因簇2与基因表达和DNA复制有关，其表达量会在早期时间点迅速增加，准备传代时降低，而在传代后再次升高，反映了动态的增殖反应；而与脂质代谢过程相关的基因簇7中则呈现了截然相反的态势，即在早期时间点表达迅速减少，准备传代时增加，传代后再次下降。
为了进一步探究单纯肝细胞中的动态变化，研究人员通过获取单细胞FH并再次进行了类器官再生的早期转录组观测，结果与此前保持一致。另外，形态学上，早期单个FH只表现脂肪积累，并不进行复制增殖；48小时内，FH完成第一轮分裂，脂质表型在此时同步消失；培养三天后，无脂质的多细胞FH类器官最终形成。该形态学变化反映脂质代谢信号确乎与生长相关信号存在有紧密关联。
图1：FH类器官生长过程中，组织簇2和7的RNA-seq结果
使用生长信号及细胞因子优化FH类器官培养基
对于基因簇2而言，Wnt被认为深度参与细胞的增殖与分化。当移除Wnt信号通路激活剂RSPO1后，类器官生长无显著影响；而移除另一激活剂CHIR后，FH类器官则会迅速凋亡。此外，在添加cAMP激活剂forskolin (FSK) 和糖皮质激素类似物地塞米松 (Dex) 后诱导分化后，胆管细胞类器官生长被激活，肝细胞类器官则表现出多角形形态、体积增大等成熟特质。
除此以外，细胞因子也可显著促进FH类器官生长，具体效果则是NRG1>IL6>IL11。
图2：添加不同生长因子的FHs在从单个FHs出芽7天后的直径对比
PHH类器官培养中的停滞
完成FH相关机制的探索之后，研究人员很快在PHH上观察到了不一样的转录组图谱。PHH会在长出小型类器官后停止增长，且在传代后也无法恢复增长；与此同时，基因簇2和7的表达水平在传代后保持平稳，而非升高（基因簇2）或降低（基因簇7）到早期水平，指示增殖与脂质代谢无法重启。经典衰老标志物CDKN1A (p21)的发现，也证实体外培养的PHH确已进入生长停滞状态。
图3：PHH类器官生长过程中基因簇2和7表达热图
生长因子IL6及脂质代谢因子FXRa诱导PHH体外发育
通过探索FH类器官培养中得到的思路，研究人员试图添加类似的生长因子进行诱导。在FHs上表现卓越的生长因子中，只有白介素6 (IL6) 对PHH类器官表现出了显著的激活效应，观测到明显的类器官直径增加。IL6由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多细胞产生，深度参与并调节多种细胞的生长与分化、免疫应答与炎症反应等。此前已经发现血液IL6水平会于部分肝的切除术后迅速增加，并显著影响肝切除后再生的效果与速度。且有文章报道，IL6可以将肝细胞转化为保持分化为肝细胞能力的诱导性肝祖细胞 (iHPCs)，促进小鼠原代肝细胞在体外的长期扩展，支持建立单个肝细胞衍生的iHPC克隆等。因此，本研究将IL6的促进生长效果推演到了辅助PHH类器官体外培养的有效条件，论证其可作为体外肝细胞长期培养的支持组分之一。
不过，当只添加IL6时，PHH类器官仍表现出与生长同步的脂质积累，而细胞分化似乎未被诱导成功。研究团队随后加入了法尼醇X受体 (farnesoid X receptor, FXR) 激动剂。FXR是一类胆汁酸受体，其中a1/2亚型主要在肝脏和肾上腺中表达并调控脂质代谢。此前有动物实验表明，激活FXR可显著降低游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇等积累，并呈现质量效应。而使用非甾体FXR激动剂Cilofexor则会降低人类肝脂肪变性和血清胆汁酸水平。本文使用FXRa抑制脂质积累，变相进一步促进了PHH类器官发育。
此外，为了消除潜在的衰老标志物p21，研究团队还添加了经典的类器官培养细胞因子Noggin。Noggin可抑制BMP信号，以保持维持肝前体细胞未分化状态，催动其向成熟肝细胞和胆管细胞分化。
最终的培养基方案被证实可持续扩增PHH类器官至少四个月。
图4：PHHs的培养基优化
总结与展望
本研究中，研究团队追踪FH类器官培养中的时间转录组和表型变化，发现了增殖启动和脂质代谢抑制的同步性。并据此对PHH类器官的培养条件进行了模拟优化，通过IL6促进增殖启动、FXRa抑制脂质代谢、Noggin抑制衰老辅助分化，成功达成了PHH类器官体外四个月培养的阶段性成果，单细胞RNA测序也证实了其成年肝细胞身份。这一结果不仅揭示了决定肝细胞从发育到成年增殖的有丝分裂原需求和代谢差异，也为进一步探索体外PHH类器官的构建提供了重要依据。
不过作者也在文中特别提到，该研究中所使用的肝细胞来源人数有限，且捐赠者整体年龄偏低，未来需要在更多捐献者中进行个性化多样化测试，以确保药物利用的普适性。
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